Laboratorio del corso di Biochimica del Metabolismo

Procedura sperimentale:

lisi dei batteri

• Prelevare 200 µl di coltura batterica, trasferire in eppendorf e centrifugare a 13000 rpm (centrifuga eppendorf) per 1 minuto
• Eliminare il sopranatante e sciogliere il pellet batterico in 250 µl di Soluzione O, congelare
• Raccogliere il resto dei batteri centrifugando a 4000xg (centrifuga da cellule) per 10 minuti a temperatura ambiente
• Risospendere il pellet batterico in 1.2 ml di tampone di lisi trasferire in provetta eppendorf da 2 ml
• Procedere a 6 cicli di congelamento rapido in azoto liquido seguito da scongelamento a 37°C (freezing and thawing)
• Passare i batteri lisati attraverso un ago di una siringa per ridurre la viscosita’ dovuta alla presenza del DNA batterico
• Centrifugare a 13000 rpm (centrifuga eppendorf) per 20 minuti a temperatura ambiente

legame della proteina alla resina di affinita’, lavaggi ed eluizione della proteina

• Trasferire il sopranatante LIMPIDO nella provetta eppendorf contenente 250 ml di resina Ni-NTA equilibrata in tampone di lisi (lavata 2x con 125 µl di tampone di lisi)
• Incubare a 4°C agitando su tamburo rotante per 1 ora
• Trasferire la resina nella colonnina e raccogliere in una eppendorf  l’eluato, lasciare passare quasi tutta la fase mobile
• Lavare la resina nella colonna con il tampone di lavaggio per 4 volte, facendo passare 1 ml alla volta e raccogliendo le frazioni
• Procedere all'eluizione della proteina facendo passare attraverso la colonnina (e raccogliendo separatamente) le seguenti soluzioni a concentrazione crescente di imidazolo:
  • 1 ml 30 mM
  • 1 ml 200 mM
  • 250 µl 300 mM
• Esaminare al transilluminatore UV la fluorescenza delle diverse frazioni di eluato

 

2. preparazione gel di poliacrilammide per l'elettroforesi in presenza di SDS (SDS-PAGE)

Soluzioni

Acrilammide 40 %
Acril. : Bisacr. 29.2 : 0.8

Soluzione L
1.5 M Tris/Cl pH 8.8
0.4% SDS

Soluzione M
0.5 M Tris/Cl pH 6.8
0.4% SDS

Glicerolo 50%

APS 10%  (ammoniopersolfato)

TEMED

Procedura sperimentale:

• Assemblare sull’apposito sostegno i vetri tra i quali verra’ polimerizzato il gel di poliacrilammide
• Indossare i guanti di protezione!!!
• Preparare il gel di separazione mescolando in una provetta da 15 ml:
• 2.5 ml di Acrilammide 40%
• 2.5 ml di Soluzione L
• 3.8 ml di Glicerolo 50 %
• 1.2 ml di H2O
• 25 µl APS
• 10 µl di TEMED
• Dopo aver accuratamente mescolato versare tra i vetri con una pipetta pasteur la soluzione fino a 1.5 cm dal bordo
• Stratificare dell’H2O sopra il gel per livellarlo e aspettare la sua polimerizzazione
• Dopo la polimerizzazione asciugare l’H2O con della carta assorbente
• Preparare il gel di impaccamento mescolando in una provetta da 15 ml:
• 0.5 ml di Acrilammide 40%
• 1.25 ml di Soluzione M
• 1 ml di Glicerolo 50 %
• 2.25 ml di H2O
• 34 µl di APS 10%
• 9 µl di TEMED
• Versare la soluzione con una pipetta pasteur, inserire il pettine facendo attenzione a non fare bolle, aspettare la polimerizzazione
• A polimerizzazione avvenuta, avvolgere i vetri contenenti il gel in una membrana impermeabile (ad es.: domopack) che impedisca l'evaporazione del tampone. In questo modo il gel si conserverà inalterato fino al suo utilizzo che avverrà il giorno successivo.

 

 

GIORNO 2

Analisi elettroforetica, spettrofotometrica e fluorimetrica dei campioni

 

1. preparazione campioni, caricamento, corsa elettroforetica, colarazione e decolorazione del gel

Soluzioni

Tampone di corsa 1X
0.192 M Glicina
25 mM Tris
0.1% SDS

Soluzione O 5X
0.3 M Tris/Cl pH 6.8
11.5% w/v SDS
50% w/v glicerolo
150mM Ditiotreitolo
0.1% w/v blu di bromofenolo

Soluzione di colorazione
0.1 % coomassie brillant blu R250
40 % v/v etanolo
5% v/v acido acetico glaciale

Soluzione decolorante
40% v/v metanolo
7 % v/v acido acetico glaciale

Procedura sperimentale:

• Preparare 500 ml di tampone di corsa 1X
• Montare l’apparecchiatura per l’elettroforesi
• Versare il tampone di corsa
• Togliere il pettine e lavare accuratamente i pozzetti con una siringa con il tampone di corsa
• Preparare 7 provette eppendorf con 6 µl di Soluzione O
• Trasferire in ciascuna provetta 24 µl dei seguenti campioni: frazione solubile ottenuta dalla rottura dei batteri, non trattenuto, lavaggio n° 1, lavaggio n° 4, eluizione 30-200-300 mM imidazolo
• Incubare a 37°C per 10 minuti i campioni con imidazolo
• Bollire per 2 minuti gli altri campioni (compresi i campioni di batteri interi preparati il giorno 1°)
• Prima di caricare i campioni lavare nuovamente i pozzetti, caricare con una p200 20 µl dei campioni preparati, caricarne 10µl nel caso del campione eluito in 200mM imidazolo. Nell’ultimo pozzetto caricare 20 µl degli standard di peso molecolare.
• Collegare l’apparecchio da elettroforesi al generatore di corrente
• Applicare una differenza di potenziale di 60 V fino all’entrata dei campioni nel gel di impaccamento quindi aumentare la differenza di potenziale a 120V

Attenzione: la colorazione del gel a fine corsa comporta l'impiego di una sostaza (il coomassie blu) fortemente colorata e di soluzioni (ad esempio quella decolorante) che possono danneggiare, se utilizzate impropriamente, i vestiti. E' quindi necessario indossare i guanti, eventualmente anche un camice, ed in ogni caso avere la massima attenzione nell'esecuzione di queste operazioni.

• Al termine della corsa (quando il colorante ha raggiunto il fondo del gel) spegnere il generatore di corrente, staccare i morsetti e nel lavandino eliminare il tampone di corsa
• Togliere i vetri dal supporto, con una spatolina fare leva tra i due vetri per aprirli, staccare il gel dagli spaziatori e facendo attenzione a non romperlo (FRAGILISSIMO) trasferirlo nella soluzione di colorazione (50 ml).
• Eventualmente, prima di immergerlo nella soluzione colorante, osservarlo in luce ultravioletta. La posizione della GFP, trattandosi di una proteina fluorescente, dovrebbe essere chiaramente visibile. Considerata la fragilità del gel questa operazione va fatta sotto la supervisione del docente
• Incubare  sotto lenta agitazione per 20 minuti
• Recuperare la soluzione di colorazione e aggiungere 50 ml di soluzione decolorante
• Eliminarla subito e aggiungere altri 50 ml di soluzione decolorante
• Incubare sotto agitazione fino alla completa decolorazione
• Osservare al transilluminatore

2. analisi spettrofotometrica delle frazioni raccolte

• Azzerare lo spettrofotometro nell'intervallo compreso fra 400 e 600 nm utilizzando il tampone di eluizione 30 mM imidazolo.
• Misurare l’assorbanza della frazione contenente le proteine non trattenute dalla colonna e delle frazioni raccolte durante il lavaggio e eluite dalla colonna in presenza di imidazolo: prelevare 20 µl di ogni frazione ottenuta durante la cromatografia, portarli ad un volume di 800 µl con tampone di lavaggio e procedere alla misura con lo spettrofotometro

 

2. analisi fluorimetrica della proteina purificata: la risposta al pH

Soluzioni

Tampone pH acido (pH 3-5.5)
50mM Acido Citrico/Sodio Citrato

Tampone pH neutro (pH 6-8)
50mM Potassio Fosfato monobasico/ Sodio Fosfato bibasico

Tampone pH basico (pH 8.5-10)
50mM Glicina/ Sodio idrossido

 

Procedura sperimentale:

• Azzerare il fluorimetro nell'intervallo compreso fra 400nm e 500nm per le misure di assorbimento, registrando il segnale di emissione a 525nm; fra 500nm e 600nm per le misure di emissione, eccitando ad una lunghezza d'onda fissa di 485nm.Utilizzare di volta in volta il tampone per l'intervallo di pH considerato.
• Prelevare 20 µl della frazione ottenuta durante l'eluizione, portarli ad un volume di 2 ml con il tampone adeguato e procedere alla misura con il fluorimetro
• Registrare gli spettri di emissione e di l’assorbimento della frazione contenente la proteina ai diversi pH