Laboratorio del corso di Biochimica del Metabolismo

Corso di Laurea in Biotecnologie

Produzione di una Proteina Ricombinante

Spettroscopia UV-Visibile _ Emissione in fluorescenza

L’assorbimento di radiazione elettromagnetica avente lunghezze d’onda caratteristiche della regione del visibile ( = 400 – 750 nm) e dell'ultraviletto (< 400 nm), determina transizioni tra Stati Elettronici diversi, in particolare dallo stato elettronico fondamentale (il solo popolato a T ambiente) ai diversi stati elettronici eccitati. I diversi stati elettronici si differenziano per gli orbitali (atomici o molecolari) occupati dagli elettroni.

Le transizioni in assorbimento corrispondono perciò al passaggio di uno o più elettroni da orbitali occupati nello stato fondamentale ad orbitali a maggior energia. La maggior parte delle molecole, nello stato elettronico fondamentale, si trova in uno stato cosiddetto di singoletto, S0, o fondamentale (tutti gli elettroni con spin appaiati, 2 elettroni per orbitale molecolare). L'assorbimento di radiazione più probabile è quello che avviene verso uno stato di singoletto eccitato: S1, S2 , …, Sn (primo, secondo, etc. n-esimo stato di singoletto eccitato) a seconda della lunghezza d'onda del fotone assorbito.

Una molecola che si trovi in uno stato elettronico eccitato tende spontaneamente a perdere l'eccesso di energia e a portarsi allo stato elettronico fondamentale. Uno dei possibili modi di diseccitazione è attraverso l'emissione spontanea di radiazione elettromagnetica, di frequenza corrispondente alla differenza di energia tra i due stati.

Poichè ciascuno degli stati elettronici presenta più stati vibrazionali, a temperatura ambiente, una molecola che viene eccitata, si può trovare ad un livello vibrazionale qualsiasi dello stato elettronico eccitato. Se si tratta di un livello vibrazionale eccitato, il primo processo che avviene (il più rapido), in soluzione, è la cessione dell'eccesso di energia vibrazionale, mediante urti, alle altre molecole, cioè fondamentalmente con aumento dell'agitazione termica dell'ambiente (calore). A causa di questo rilassamento vibrazionale, una parte dell’energia dello stato eccitato è convertita in energia termica, e lo spettro di emissione risulta spostato a lunghezze d’onda maggiori rispetto a quello di assorbimento (legge di Stokes).

Se sia lo stato eccitato sia quello fondamentale sono stati di singoletto, l'emissione spontanea viene detta Fluorescenza. (Più correttamente, la fluorescenza è l'emissione spontanea che comporta una transizione elettronica senza cambiamento di spin). La fosforescenza è un fenomeno associato alla fluorescenza ma ha tempi di decadimento maggiori ed in genere permane anche quando l'energia di eccitazione non è più applicata.
Il principale vantaggio dell'utilizzo della fluorescenza rispetto alle misure di assorbimento è la maggiore sensibilità dal momento che il segnale di fluorescenza parte da un background pari a 0.Molte molecole organiche assorbono nel visibile e nell'U.V. ma solo poche di esse sono fluorescenti. Tuttavia molte di queste sono di interesse biologico. Gruppi fluorescenti nelle proteine sono:Trp, Tyr, Phe.

 

Il fluorimetro

Un tipico fluorimetro contiene una sorgente d'eccitazione, una cella per il campione, un rilevatore. Le molecole in soluzione sono normalmente eccitate da raggi UV e la sorgente d'eccitazione è una lampada di deuterio o xenon. La luce proveniente dalla lampada passa attraverso un monocromatore. La fluorescenza viene dispersa da un'altro monocromatore e rivelata da un tubo fotomoltiplicatore.

 

Questa è una foto del fluorimetro che useremo in laboratorio:

 

fluorimetro